Arbeitsgemeinschaft Klinische Mykologie

45. Arbeitsgruppentagung „Klinische Mykologie“ der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft (DMykG) am 7. bis 8. Februar 2014

In der gemeinsamen Key Note Lecture referierte Prof. Dr. rer nat. Klaus Brehm (Würzburg) über neueste Erkenntnisse zur Entwicklungsbiologie und Parasit-Wirt-Interaktion bei Echinococcus multilocularis. Er hob hervor, dass das potenziell unbegrenzte Wachstum der Larve von Echinokokken im Zwischenwirt durch kürzlich entdeckte pluripotente Stammzellen ermöglicht wird, welche die einzigen proliferativen Zellen im Metacestoden-Stadium darstellen. Da sie entscheidend für die Pathogenese der Echinokokkose sind, sind sie ein wichtiges neues Target für Chemotherapeutika gegen die Echinokokkose.

Im Workshop der AG Tagung berichtete Dr. med. Johannes Wagener (München) über seine Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der beta-1,3-Glucansynthase von Aspergillus fumigatus. Die beta-1,3-Glucansynthase ist Angriffspunkt der Echinocandine. Im Gegensatz zu Sprosspilzen wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae verfügt A. fumigatus nur über eine katalytische Untereinheit des beta-1,3-Glucansynthase-Komplexes, Fks1. Um die Bedeutung der beta-1,3-Glucansynthase für das Wachstum, die Stressresistenz und die Antimykotika-Resistenz zu untersuchen, wurde der Promotor des fks1-Gens durch einen regulierbaren Promotor ersetzt. Eine reduzierte fks1-Expression führt zu deutlich verlangsamtem Wachstum, zur Unterdrückung der Sporenbildung und zu einer erhöhten Sensitivität gegenüber Zellwandstress. Zugleich wird das Wachstum der Mutante bei reduzierter fks1-Expression nicht durch Echinocandine beeinträchtigt. Darüber hinaus berichtete Johannes Wagener von einer neuen Zielstruktur, deren Inhibierung die Wirksamkeit der Echinocandine auf A. fumigatus verbessern könnte.

Bei der von der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. med. Utz Reichard (Göttingen) untersuchten potenziellen Impfstoffkandidaten gegen eine invasive Aspergillose wurden sowohl Konidien-Oberflächenantigene als auch diverse metabolische Antigene von A. fumigatus näher untersucht. Einige dieser Antigene könnten auch pharmakologische Targets für eine Chemotherapie sein. Die kodierenden Gene eines Konidien-Hauptoberflächenproteins (HP 16) und einer intrazellulären Peroxidase (Aspf 3) wurden durch homologe Rekombination aus dem Genom von A. fumigatus entfernt. In vorläufigen Studien lässt sich im Tierversuch eine verminderte Virulenz erkennen. Die Komplementierung der Mutanten und Restaurierung der Virulenz ist in Arbeit. Die Versuche finden in einem engen kooperativen Ansatz mit den Arbeitsgruppen von Prof. Dr. rer nat. Axel Brakhage (Jena) und Prof Dr. rer. nat. Sven Krappmann (Erlangen) statt.

C. albicans ist der bedeutendste humanpathogene Pilz in nosokomialen Blutstrominfektionen. Bisher ist nur wenig über das Zusammenspiel der verschiedenen zellulären und nicht-zellulären Bestandteile der angeborenen Immunität, die eine schützende Immunantwort gegen C. albicans im Blut vermittelt, bekannt. Wie Prof. Dr. med Oliver Kurzai (Jena) berichtete, ermöglicht die Anwendung eines humanen Vollblutinfektionsmodells eine zeitlich aufgelöste Analyse der Lokalisierung und des physiologischen Zustandes von C. albicans sowie der Immunaktivierung vergleichbar zum in vivo-Scenario einer systemischen Pilz-Infektion (Hünniger et al., 2014). Um aus den experimentellen Ergebnissen der Wirt-Pathogen-Interaktion a priori unbekannte Kinetiken der Aktivierung angeborener Immunreaktionen quantifizieren sowie die Hauptachse der antifungalen Immunität ermitteln zu kön- nen, wurden die Daten mittels biomathematischer Modellierung simuliert und ein virtuelles Infektionsmodell entwickelt. Die Ergebnisse unterstreichen die zentrale Rolle der neutrophilen Granulozyten bei der Abwehr von C. albicans. Diese Phagozyten nehmen Pilz-Zellen effektiv auf, um diese intrazellulär zu töten, und sezernieren antimikrobielle Effektormoleküle, was in einer Erhöhung der extrazellulären fungiziden Aktivität resultiert. Beide Mechanismen in Kombination vermitteln nahezu 98% der gesamten Abtötung von C. albicans im Blut. Darüber hinaus sagt das Modell eine Population von Pilzzellen voraus, die im Verlauf der Infektion resistent gegenüber der Phagozytose durch Immunzellen werden und somit extrazellulär und lebend verbleiben. Hieraus ergibt sich eine mögliche Erklärung für die Disseminierung von C. albicans im Verlauf einer systemischen Infektion.

In der zweiten gemeinsamen Key Note Lecture trug Prof Dr. rer. nat. Hubertus Haas (Innsbruck) über den Eisenstoffwechsel, einer Schlüsselstelle in der Virulenz von Pilzen vor. Eisen ist ein essentielles Spurenelement für alle Organismen, welches aber im Überschuss toxisch wirkt. Die Arbeitsgruppe von Hubertus Haas beschäftigt sich in zahlreichen internationalen Kollaborationen mit den molekularen Mechanismen, die für die Anpassung von pathogenen Pilzen an Eisenmangel notwendig sind. Das Hauptmodell ist dabei der häufigste Krankheitserreger unter den Schimmelpilzen, A. fumigatus. So konnte die Arbeitsgruppe unter anderem zeigen, dass die Biosynthese von Siderophoren (niedermolekular Chelatoren, die zur Eisenaufnahme und intrazellulären Eisenspeicherung verwendet werden), sowie Regulatoren, die für die Aktivierung der Eisenaufnahme auf der Ebene der Genexpression notwendig sind (zB HapX und SrbA) nicht nur für das Wachstum unter Eisenmangel sondern auch für die Virulenz von A. fumigatus essentiell sind. Die Fähigkeit zur Anpassung an Eisenmangel stellt somit eine zentrale Funktion in der Pathogenität ein. Aufgrund der fundamentalen Unterschiede zwischen den Mechanismen, die der Aufrechterhaltung der Eisenhomöostase von Wirten und Krankheitserregern dienen, bietet der Eisenstoffwechsel ein attraktives Ziel für die Verbesserung von Diagnose und Bekämpfung von Infektionen durch Pilze.

Der zweite Workshop zur Klinik und Epidemiologie von Pilzerkrankungen wurde von Dr. rer. nat. Oliver Bader (Göttingen) eröffnet. In den letzten 10 Jahren ist die Azolresistenz bei A. fumigatus zu einem wachsenden klinischen Problem geworden. Möglicherweise ausgehend von den Niederlanden, wo dieses Phänomen zum ersten Mal für 1998 beschrieben wurde, verbreiten sich Stämme mit dem cyp51A Resistenzallel „TR/L98H“, die wahrscheinlich durch die landwirtschaftliche Nutzung von Triazol-Fungiziden induziert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Verbreitung azolresistenter A. fumigatus Stämme der Umwelt und deren Anteil an klinischen Isolaten bestimmt (Bader et al., 2013). In der Tat wurde auch in Deutschland eine Resistenzrate von ca. 3% ermittelt, wobei das TR/L98H-Allel mit ca. 40% den höchsten Einzelanteil an klinischen Resistenzen verursachte. Daneben war ein ähnlich hoher Anteil an Isolaten ohne Mutationen in cyp51A zu beobachten, was auf das Vorhandensein anderer Mechanismen in diesen Stämmen hindeutet. Das Vorkommen von cyp51A Resistenzallelen in klinischen Isolaten war eng mit deren Vorkommen in der Umwelt korreliert: für TR/L98H und TR/Y121F/T289A war ein Verbreitungskorridor mit Zentrum in der nördlichen Hälfte von Deutschland zu beobachten, wo auch der Anteil in klinische Isolaten am höchsten war.

Auch bei Anne Braun (Berlin/Lübeck) stand die Azolresistenz bei A. fumigatus im Fokus. Sie berichtete über die Detektion von cyp51A Mutationen in einem unabhängigen Satz klinischer Isolaten, welche zu Azolresistenz führten. Neben dem weit verbreiteten TR/L98H-Allel konnte auch hier in einigen resistenten Stämmen keine Mutation gefunden werden.

Im Anschluss trug Prof. Dr. med. Peter-Michael Rath (Essen) über die Relevanz von A.fumigatus-DNA im Blut vor. Seine Arbeitsgruppe analysierte retrospektiv die Bedeutung von A. fumigatus-DNA im Blut von Intensivpatienten mit SIRS mit einer kommerziell erhältlichen Multiplex-PCR (SeptiFast, Roche diagnostics). Daten der Patienten mit positivem Resultat für A. fumigatus im SeptiFast-System wurden analysiert. Die PCR Resultate wurden mit Ergebnissen der Kulturen aus respiratorisch gewonnenen Materialien und den Ergebnissen des Platelia Aspergillus Galaktomannan Antigen Assay (Bio-Rad) aus Serum und/oder respiratorischen Materialien verglichen. Radiologische und histopathologische Daten wurden den Patientenakten entnommen. Zwischen 2008 und 2013 waren 23/2224 SeptiFast-Proben positiv für A. fumigatus-DNA (1.03%). Acht Patienten waren Transplantationspatienten, 5 Patienten hatten eine hämato-onkologische Grunderkrankung, 3 Patienten hatte AIDS, 6 Patienten andere Grunderkrankungen. Bei 14/21 Patienten (67%) konnte A. fumigatus aus Materialien des Respirationstraktes angezüchtet werden, bei 17/21 Patienten war entweder die Kultur oder der Galaktomannan-Assay aus Blut oder bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit positiv. Gemäß den EORTC/MSG-Kriterien hatten zwei Patienten eine gesicherte Infektion, 17 Patienten fielen in die Kategorien „wahrscheinlich“ oder „möglich“. Die Gesamtsterblichkeit lag am Tag 28 nach positivem PCR-Resultat bei 78%. Zusammenfassend wurde von Peter Michael Rath gefolgert, dass die SeptiFast-Multiplex-PCR zum raschen Nachweis von A. fumigatus-DNA im Blut eingesetzt werden kann. Obwohl die Anzahl der Pati- enten in dieser Studie klein ist, weisen die Daten auf eine hohe Letalität im Falle eines positiven PCR-Resultates hin.

Über das Antibiotic Stewardship Projekt an der Universitätsmedizin Göttingen, mit besonderem Augenmerk auf Pilzinfektionen, wurde von Dr. med. Marco H. Schulze (Göttingen) berichtet. Antibiotic Stewardship (ABS) ist der englische Begriff zur Umschreibung eines rationalen und umsichtigen Einsatzes von Antiinfektiva. Diese Vorgehensweise ist nicht neu, jedoch brennender denn je, da die zunehmende Resistenzentwicklung die Anwendung der noch zur Verfügung stehenden wirksamen Antiinfektiva immer weiter einschränkt. Im klinischen Alltag wird durch Unsicherheit im Umgang mit Antiinfektiva oder einem falschen Sicherheitsdenken häufig unterdosiert, werden unnötige Antiinfektiva- Kombinationen verabreicht, oder es wird zu lange therapiert. Die bundesweite Initiative Antibiotic Stewardship hat die Anstrengungen für einen rationalen, einen umsichtigen Einsatz von Antiinfektiva neu belebt. Leider ist der englische Begriff nicht selbsterklärend und birgt eine erste und nicht unerhebliche Hürde für viele Ärzte im Verständnis. Seit Ende letzten Jahres existiert die S3-Leitlinie: „Strategien zur Sicherung rationaler Antibiotika-Anwendung im Krankenhaus“ (http://www. awmf.org/leitlinien/detail/ll/092-001.html). In ihr sind die Voraussetzungen und Kernstrategien für die Umsetzung eines rationalen Einsatzes von Antiinfektiva dargelegt. Die Umsetzung dieser S3-Leitlinie erfolgt durch ein sogenanntes Kern-ABS- Team, idealerweise bestehend aus einem Fachapotheker, einem Mikrobiologen und einem Infektiologen, in Kooperation mit der Arzneimittelkommission, der Hygienekommission, der Apotheke und den Vertretern klinischer Fachabteilungen (ABS-Beauftragte). Wichtige Voraussetzungen für eine effektive Arbeit ist die Verfügbarkeit von Daten zu Infektionserregern, Resistenz und Antiinfektivaverbrauch. Eine große Herausforderung für Antibiotic Stewardship wird sein, die Prognose invasiver Pilzinfektionen zu verbessern. Neben therapeutischen Überlegungen werden hier vor allem das Bewusstsein für eine frühzeitige und Entwicklungen hin zu einer zuverlässigeren Diagnostik eine wichtige Rolle spielen.

Im dritten Workshop wurden Themen zur Qualitätssicherung in der mykologischen Diagnostik besprochen. Ringversuche befinden sich im Spannungsfeld zwischen Aufwand und Qualitätssicherung anaysierte Dipl. Biol. Roman Schwarz (Mönchengladbach). Durch die Richtlinie der Bundesärztekammer (RiLiBÄK) zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen vom 23.8.2013 sind sowohl interne als auch externe Maßnahmen zur Qualitätssicherung vorgeschrieben. Dies gilt mit einer Übergangsfrist bis zum 31.03.2015 auch für den direkten Nach- weis und die Charakterisierung von Infektionserregern (RiLiBÄK Teil B3). Speziell für die Mykologie stehen zurzeit fünf Ringversuche bei INSTAND e. V. zur Verfügung: 1. Mykoserologie Candida Antigen-Nachweis (480), 2. Mykoserologie Cryptococcus Antigen-Nachweis (481), 3. Anzüchtung und Identifikation von Sprosspilzen und Hyphomyzeten (490), Identifikation von Dermatophyten, Hefen und Schimmelpilzen (491) und 5. Pilzgenom-Nachweis Pneumocystis jirovecii (560).
Noch keine Ringversuche sind für Biomarker wie z. B. den Glucan- oder Galaktomannan-Nachweis oder verschiedene PCR-Methoden verfügbar. Eine weitere Lücke betrifft die Empfindlichkeitsprüfung sowohl der Spross- als auch der Schimmelpilze.

Von Dipl. Biol. Michael Seibold (Berlin) wurde zum INSTAND-Ringversuch 481 (Cryp- tococcus-Serologie) vorgetragen. Nach §4a Medizinprodukte-Betreiberverordnung sind für laboratoriumsmedizinische Untersuchungen im Bereich der Heilkunde eine ständige interne Qualitätskontrolle und die Teilnahme an Ringversuchen nach der RiLiBÄK 2008 (Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen) vorgeschrieben. Die RiLiBÄK fokussieren auf grundlegende Anforderungen an die Qualitätssicherung, die Etablierung eines Qualitätsmanagementsystems sowie auf die Durchführung interner und externer Qualitätskontrollen. Verstöße gegen diese Bestimmungen, die für den Teil B3 spätestens bis zum 31.03.2015 zu erfüllen sind, können formal Sanktionen nach sich ziehen. Der Antigen-Nachweis von Cryptococcus neoformans ist dort in der Tabelle B 3-2 gelistet und somit die Teilnahme Pflicht. INSTAND e.V. ist von der Bundesärztekammer als Referenzinstitution zur Durchführung des Ringversuchs „Kryptokokkose“ beauftragt worden und führt seit 1996 zusammen mit dem Konsiliarlaboratorium Cryptococcus neoformans, Pseudallescheria boydii / Scedosporium sp. und Erreger außereuropäischer Systemmykosen am Robert Koch-Institut (Berlin) als Referenzlabor diesen Ringversuch durch. Für die von der BÄK ernannten Referenzinstitutionen, die Ringversuche durchführen, sind im Teil E der RiLiBÄK die allgemeinen Anforderungen beschrieben, sowie weitere spezielle Anforderungen, die sich nach Art der Untersuchung richten. Unter anderem muss die Referenzinstitution nachweisen, dass sie ein „Qualitätsmanagementsystem unterhält, Zuverlässigkeit und Sachkenntnis aufweist und über Referenzlaboratorien oder Sollwertlaboratorien in ausreichender Anzahl verfügt, die für die jeweiligen Aufgaben qualifiziert sind“. INSTAND e.V., seit 1994 Mitglied im WHO Collaborating Centre for Quality Assurance and Standardization in Laboratory Medicine, erhält voraussichtlich im Februar 2014 die Akkreditierungs-Urkunde nach der seit 2010 geltenden ISO-Norm 17043, die deutlich über der Norm EN 14136, nach der INSTAND e.V. bisher akkreditiert ist, durch die Deutsche Akkreditierungsstelle (DAkkS). Das Referenzlabor im Robert Koch-Institut (RKI) ist (für ausgewählte Verfahren) seit Ende 2012 auf der Basis der DIN EN ISO 15189 und DIN EN ISO/IEC 17025 durch die DAkkS akkreditiert und legt die qualitativen und semiquantitativen Anforderungen an die Untersuchung und (in Absprache mit INSTAND e.V.) die Bewertung der Teilnehmer-Ergebnisse fest. Das Referenzlabor am RKI wird unterstützt von 6-7 Sollwertlaboren. INSTAND e.V. beschreibt in einer Verfahrensanweisung (VA) den Ablauf des Ringversuchs zur Kryptokokkose (Ringversuch 481 Mykoserologie 2). Schwerpunkte sind die Anforderungen an die Proben, insbesondere neben der Auswahl die Probenstabilität und Homogenität, die nach einer weiteren VA auf diese Eigenschaften zu prüfen sind. Am RKI bestehen für den o.g. Ringversuch eine entsprechende VA sowie eine SOP, um diese Anforderungen zu erfüllen. Die RiLiBÄK, in die einschlägige Normen und Erfahrungen auch aus dem Ausland eingeflossen sind, beruht auf einer gesetzlichen Grundlage bei der Durchführung bestimmter laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen. So ist die Teilnahme an Ringversuch Kryptokokkose von INSTAND e.V. Pflicht, wenn diese Untersuchung vorgehalten wird. Das Konsiliarlaboratorium Cryptococcus neoformans, Pseudallescheria boydii / Scedosporium sp. und Erreger außereuropäischer Systemmykosen am Robert Koch-Institut (Berlin) stellt INSTAND e.V. seit 1996 Proben zur Verfügung und übernimmt die Auswertung. Während anfänglich nur ca. 80% der halbjährlich ca. 100 Teilnehmer alle Vorgaben richtig erfüllten, ist die Bestehensquote der aus 11 europäischen Ländern stammenden Teilnehmer auf 90–95%angestiegen. Fachgesellschaften können weiterhin über Leitlinien und Empfehlungen Einfluss auf eine gute Laborpraxis und das Qualitätsmanagement nehmen.

Prof. Dr. rer. nat. Gerhard Haase (Aachen) berichtete über die Entwicklungen beim kulturellen mykologischen Ringversuch RV 490 (Identifizierung von Hefen und Hyphomyzeten) seit seiner Entstehung im Jahr 1997. Hierbei wurde insbesondere über die bislang ausgesandten Isolate, die Methoden und den Stellenwert der Resistenztestung bei Pilzen, sowie methodische Veränderungen in der Speziesdiagnostik, vor allem seit Einführung der MALDI-TOF MS basierten Diagnostik, in das mykologische Labor diskutiert.
Im Anschluss daran wurde von Prof. Dr. med. Michael Weig (Göttingen) über die Auswirkungen der RiLiBÄK auf den mykoserologischen Ringversuch 480 (Candida Serologie, INSTAND e.V.) vorgetragen. In der aktuellen RiLiBÄK werden nun in der Tabelle 2.2 (Externe Qualitätssicherung/Ringversuche) des B2-Teils (Qualitative laboratoriumsmedizinische Untersuchungen): „Candida albicans, Antikörper gegen“ und in Tabelle 3.2 (Externe Qualitätssicherung/Ringversuche) des B3-Teils (Direkter Nachweis und Charakterisierung von Infektionserregern): „Candida, Antigen-Nachweis“ benannt. Diese geforderten qualitativen Parameter sind in den von INSTAND e.V. vergebenen Zertifikaten nun explizit ausgezeichnet. Bislang wird im Rahmen des Ringversuchs auch eine klinische Bewertung und Befundinterpretation gefordert. Es erfolgte eine ausführliche Diskussion der AG Klinische Mykologie über Probleme, die bei der Durchführung des mykologischen Ringversuchs bestehen. Hierbei wurden u.a. folgende Themen besprochen: Heterogenität der kommerziellen Testantigene und Vergleichbarkeit der Ergebnisse, Gewinnung einer ausreichenden Menge standardisierter Ringversuchsseren, Stellenwert des klassenspezifischen Nachweises von Anti-Candida Antikörpern, Stellenwert wenig sensitiver Agglutinationstests zum Nachweis von Candida Antigenen und Notwen- digkeit der Aufnahme weiterer Tests in die Ringversuche.

Den Ringversuch Pneumocystis-PCR stellte Dr. Ingrid Reiter-Owona (Bonn) vor. Zusammen mit Prof. Dr. Udo Reischl (Regensburg) leitet sie diesen INSTAND e.V. Ringversuch. Der Erreger Pneumocystis jirovecii, früher als P. carinii bezeichnet, verursacht die bei immunsupprimierten Patienten gefürchtete Pneumocystis- Pneumonie (PCP). Bei immunsupprimierten Patienten mit HIV-Infektion zeichnet sich die PCP durch eine fortschreitende Dyspnoe mit hoher Erregerdichte im Untersuchungsmaterial aus, während PCP-Patienten mit durch Medikamente induzierter Immunsuppression auch bei geringer Erregerdichte schnell eine schwere respiratorische-Insuffizienz entwickeln können. Die Diagnose der PCP basiert auf dem Erregernachweis im Untersuchungsmaterial (BAL, induziertes Sputum). Färbemethoden (Giemsa, Grocott u.a.) sind weniger sensitiv und spezifisch als die molekularbiologische Diagnostik, so dass insbesondere bei HIV-negative Patienten der Erregernachweis mittels PCR als „Goldstandard“ gilt. Zur Überprüfung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität der zahlreichen in-house und wenigen kommerziellen PCRs wurden im Mai und November 2013 erstmals Ringversuche durch INSTAND e.V. durchgeführt. Die sehr guten Ergebnisse von ca. 60 Teilnehmern pro Ringversuch zeigen, dass in-house und kommerzielle PCRs im Verhältnis von ca. 1,5 :1 eingesetzt werden und das Detektionslimit aller Systeme bei